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如何量化细菌培养——从CFU 和OD 到计数板方法
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引言
许多标准程序和检测首先需要依赖科研人员准确计算细菌细胞数量或确定细菌细胞密度。细胞计数对于监测细胞生长、评估转化与抗筛能力、接种细胞进行后续研究以及细胞检测准备工作至关重要。细菌细胞计数必须准确一致，尤其是对下游定量测量而言。
本文将简要介绍每种手动细菌细胞计数方法，并分析其优缺点。无论是为分析蛋白表达进行分批培养、准备转化实验，还是测量细胞对不同刺激的定量反应，都必然会用到其中至少一种计数方法。通过阅读本文，您将找到适合自身工作的细胞计数方法。
许多标准程序和检测首先需要依赖科研人员准确计算细菌细胞数量或确定细菌细胞密度。细胞计数对于监测细胞生长、评估转化与抗筛能力、接种细胞进行后续研究以及细胞检测准备工作至关重要。细菌细胞计数必须准确一致，尤其是对下游定量测量而言。
本文将简要介绍每种手动细菌细胞计数方法，并分析其优缺点。无论是为分析蛋白表达进行分批培养、准备转化实验，还是测量细胞对不同刺激的定量反应，都必然会用到其中至少一种计数方法。通过阅读本文，您将找到适合自身工作的细胞计数方法。
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菌落形成单位（CFU）
菌落形成单位（CFU）是一种直接测量活细菌细胞数量的方法，指可在培养基平板上生长的任何微生物单个菌落数量。CFU的标准计量单位是每1 mL培养物中可培养微生物的数量（CFU / mL），由图1中所示连续稀释法和铺板法确定。
菌落形成单位（CFU）是一种直接测量活细菌细胞数量的方法，指可在培养基平板上生长的任何微生物单个菌落数量。CFU的标准计量单位是每1 mL培养物中可培养微生物的数量（CFU / mL），由图1中所示连续稀释法和铺板法确定。
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细菌培养物定量分析——菌落形成单位（CFU）测定法
通用方法：
例如，数得每板菌落数量为150，稀释倍数为1:100，铺板体积为100 µL：
总稀释倍数 = 0.1 mL x 1/100 (or 0.01) = 0.001
菌落总数 = 150 / 0.001 = 150,000 CFU / mL
优势：操作简单，无需使用专业设备。
缺点：菌落形成需要时间，过程十分缓慢。
- 运用1:10连续稀释法稀释批培养物，即取1 mL前次稀释液加入装有9 mL无菌蒸馏水的试管中
- 吸取100 µL稀释液，用细胞涂布棒涂布于含合适培养基的琼脂平板上
- 在平板上标明稀释倍数（DF），进行过夜培养（或视需要调整）。（DF = 稀释液总体积/样本体积）
- 选择一块菌落数量处于合理区间的平板（30 - 300个菌落）
- 然后开始计数吧！数数每块平板上能看到的菌落数量。
- 得到每块平板的CFU后，按以下方法进行计算：
例如，数得每板菌落数量为150，稀释倍数为1:100，铺板体积为100 µL：
总稀释倍数 = 0.1 mL x 1/100 (or 0.01) = 0.001
菌落总数 = 150 / 0.001 = 150,000 CFU / mL
优势：操作简单，无需使用专业设备。
缺点：菌落形成需要时间，过程十分缓慢。
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光密度（OD）测量
光密度由分光光度计测定，可快速估算出细胞数量。此方法广泛用于评估微生物生长指标，是监测发酵过程中细胞生长情况的有效方法。细胞生长并非线性过程，而是由不同生长阶段组成，能够反映不同细胞状态和环境条件。在分批培养过程中，典型的细菌生长曲线分为四个生长阶段：
光密度由分光光度计测定，可快速估算出细胞数量。此方法广泛用于评估微生物生长指标，是监测发酵过程中细胞生长情况的有效方法。细胞生长并非线性过程，而是由不同生长阶段组成，能够反映不同细胞状态和环境条件。在分批培养过程中，典型的细菌生长曲线分为四个生长阶段：
- 迟缓期，指数式增长前的适应阶段；
- 指数期或对数期，细胞以恒定速度分裂生长；
- 稳定期，此时环境条件不利于生长，细菌停止增殖；
- 衰亡期，此时细胞丧失活性。
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测量样本光密度是判断培养物生长阶段的最简便方法。
将样本置于透明比色皿或微孔板中，测定光散射系数或浊度，并与培养基空白组进行对比。培养物样本的光散射量取决于细胞浓度、细胞大小以及分光光度计配置。因此，要根据测得的OD值准确估算细胞浓度，必须针对每种菌株单独校准分光光度计。方法是先测定同一细胞悬液若干稀释液的OD值，再按上文所述方法测量这些稀释液的CFU，最后绘制出培养物密度与OD值之间相互关系的标准曲线，如图2所示。
将样本置于透明比色皿或微孔板中，测定光散射系数或浊度，并与培养基空白组进行对比。培养物样本的光散射量取决于细胞浓度、细胞大小以及分光光度计配置。因此，要根据测得的OD值准确估算细胞浓度，必须针对每种菌株单独校准分光光度计。方法是先测定同一细胞悬液若干稀释液的OD值，再按上文所述方法测量这些稀释液的CFU，最后绘制出培养物密度与OD值之间相互关系的标准曲线，如图2所示。
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细菌细胞计数——光密度（OD）测量
通用方法：
b. 设置分光光度计波长，细菌计数通常设为OD600。
c. 分光光度计归零：在适合的比色皿或微孔板中加入合适的培养基和后续用于稀释细菌悬液的稀释剂，记录波长为OD600时的空白值
d. 制备多份细菌菌株稀释溶液，使用分光光度计记录OD600波长下的OD值。务必快速操作并使用冰块，以防止细菌生长！
e. 运用上文所述CFU法测得每份稀释液的细胞数量，并通过添加线性趋势线，绘制与OD测量值相对应的标准曲线
优势：一旦建立标准曲线，该方法具备检测速度极快、成本低廉、操作简便、对样本干扰小、通量高，且易于实现自动化的特点。
缺点：由于分光光度计用于测量光吸收度，因此无法直接给出细胞计数结果。需要制定校准方案，将OD测量值与细胞计数关联起来。
- 绘制OD值与细胞数量（CFU/mL）相对应的标准曲线：
b. 设置分光光度计波长，细菌计数通常设为OD600。
c. 分光光度计归零：在适合的比色皿或微孔板中加入合适的培养基和后续用于稀释细菌悬液的稀释剂，记录波长为OD600时的空白值
d. 制备多份细菌菌株稀释溶液，使用分光光度计记录OD600波长下的OD值。务必快速操作并使用冰块，以防止细菌生长！
e. 运用上文所述CFU法测得每份稀释液的细胞数量，并通过添加线性趋势线，绘制与OD测量值相对应的标准曲线
优势：一旦建立标准曲线，该方法具备检测速度极快、成本低廉、操作简便、对样本干扰小、通量高，且易于实现自动化的特点。
缺点：由于分光光度计用于测量光吸收度，因此无法直接给出细胞计数结果。需要制定校准方案，将OD测量值与细胞计数关联起来。
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显微镜直接计数
血细胞计数器是一种计数室仪器，最初用于手动计数血细胞1。如今，血细胞计数器已可用于多种细胞类型和不同应用场景，适合计算多种类型细胞总数，包括细菌细胞。该方法通过多个显微镜视野，对一定体积液体培养物的细胞进行直接计数。血细胞计数板多种多样，细胞计数网格也各不相同。其中最著名的计数网格是“Improved Neubauer”改良版计数板，其计数网格为3×3 mm计数网格，被划分为九个1 mm2的方格。每个方格又进一步分成16、100或400个子方格，形成适用于不同细胞大小的不同网格（图3）。计数板边缘采用特殊设计，能够固定特制盖玻片，使其与标记网格保持固定距离，从而形成体积已知的分隔区域。标准“通用”深度为0.1 mm，适用于哺乳动物细胞计数，但可能难以聚焦细菌等小体积细胞。
血细胞计数器是一种计数室仪器，最初用于手动计数血细胞1。如今，血细胞计数器已可用于多种细胞类型和不同应用场景，适合计算多种类型细胞总数，包括细菌细胞。该方法通过多个显微镜视野，对一定体积液体培养物的细胞进行直接计数。血细胞计数板多种多样，细胞计数网格也各不相同。其中最著名的计数网格是“Improved Neubauer”改良版计数板，其计数网格为3×3 mm计数网格，被划分为九个1 mm2的方格。每个方格又进一步分成16、100或400个子方格，形成适用于不同细胞大小的不同网格（图3）。计数板边缘采用特殊设计，能够固定特制盖玻片，使其与标记网格保持固定距离，从而形成体积已知的分隔区域。标准“通用”深度为0.1 mm，适用于哺乳动物细胞计数，但可能难以聚焦细菌等小体积细胞。
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细菌细胞计数——Neubauer计数板
对于细菌细胞，现已推出替代产品“Petroff-Hausser chamber”计数板，其深度仅0.02 mm，同时采用Improved Neubauer改良版计数室。不仅如此，Petroff-Hausser chamber计数板还配备1.5 mm厚载玻片，支持使用暗场显微镜。
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通用方法：
- 按需稀释样本，达到分光光度计能够识别的细胞浓度
- 用70%乙醇和拭镜纸清洁血细胞计数器网格，将盖玻片轻轻盖在计数室上
- 为确保样本具有代表性，先反复吹打数次，再吸取少量细胞悬液（如10 µl），滴加至计数室边缘，让细胞通过毛细作用进入计数室。等待1-2分钟让细胞沉降
- 使用显微镜，先用10倍物镜对准血细胞计数器的网格线进行对焦，再换用40倍物镜对中央1 mm2方格（如图3所示）内的细胞进行计数。为确保计数准确，细胞总数应不少于100。对于每个小方格（25个子方格），目标是每格内细胞总数不少于3个。
- 计算细胞浓度（个/mL）
细胞浓度 = 细胞数量 x 计数板专用换算系数 x 稀释倍数 / 所用方格数
例如，若样本稀释倍数为1:10， Petroff计数板（深0.02 mm）1 mm2中央方格计数得到细胞数为500个：
500 x 50,000* x 0.1 /1 = 250,000 CFU / mL
* Petroff计数板深0.02 mm，方格面积1 mm2，则每格体积为0.02 mm3。要将0.02 mm3中的细胞数换算成每毫升细胞数，必须进行以下计算：1,000/0.02 = 50,000
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优势：成本低，操作相对简单，只需使用少量样本
缺点：耗时、繁琐，人为失误可能性大
缺点：耗时、繁琐，人为失误可能性大
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总结
具体选择何种方法可能取决于实验要求。需要测定水样中的细菌数量？那么菌落形成单位法是您的理想选择。需要分批培养大肠杆菌细胞？选择OD测量法，还能追踪培养物生长阶段。还是需要为下游分析提供精确数据？此时您可能需要花点时间，使用Neubauer计数板进行细胞计数。无论您选择何种细胞计数方法，保持一致性是关键！务必仔细规划稀释步骤、小心移液，并严格把控细胞界定标准。
具体选择何种方法可能取决于实验要求。需要测定水样中的细菌数量？那么菌落形成单位法是您的理想选择。需要分批培养大肠杆菌细胞？选择OD测量法，还能追踪培养物生长阶段。还是需要为下游分析提供精确数据？此时您可能需要花点时间，使用Neubauer计数板进行细胞计数。无论您选择何种细胞计数方法，保持一致性是关键！务必仔细规划稀释步骤、小心移液，并严格把控细胞界定标准。
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参考文献：
1. Vembadi, A., Menachery, A. and Qasaimeh, M.A. (2019) ‘Cell Cytometry: Review and Perspective on Biotechnological Advances’, Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 7, p. 147. Available at: https://doi.org/10.3389/fbioe.2019.00147
2. Stoddart, M.J. (2011) ‘Cell Viability Assays: Introduction’, in M.J. Stoddart (ed.) Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. Totowa, NJ: Humana Press (Methods in Molecular Biology), pp. 1–6. Available at: https://doi.org/10.1007/978-1-61779-108-6_1.
1. Vembadi, A., Menachery, A. and Qasaimeh, M.A. (2019) ‘Cell Cytometry: Review and Perspective on Biotechnological Advances’, Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 7, p. 147. Available at: https://doi.org/10.3389/fbioe.2019.00147
2. Stoddart, M.J. (2011) ‘Cell Viability Assays: Introduction’, in M.J. Stoddart (ed.) Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. Totowa, NJ: Humana Press (Methods in Molecular Biology), pp. 1–6. Available at: https://doi.org/10.1007/978-1-61779-108-6_1.
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